卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是／TrkB／脑血管疾病发生后较常见的精神障碍类并发症。研究表明有近30%的号通患者会在卒中后5年内出现抑郁症症状[1]，严重影响患者生活质量且给社会带来了沉重经济负担。讨血目前基于单胺递质学说的府逐抗抑郁药是PSD一线治疗药物，但长期服用会诱发较为严重的瘀胶抑郁用及安全性问题[2]。中医认为PSD属“郁证”范畴，囊促病机为素体不足、生防气滞血瘀，治卒中后治法以活血化瘀、基于进神经再机制行气止痛为主。／TrkB／血府逐瘀缘起于王清任的号通《医林改错》，具有活血化瘀、讨血行气止痛之功效。府逐大量临床研究表明血府逐瘀胶囊具有缓解PSD患者临床抑郁症状、瘀胶抑郁用及改善患者生活质量的作用[3-4]，但具体机制仍需探索。
神经再生障碍是抑郁症的重要病理特征，促神经再生可减轻焦虑和抑郁样行为。脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）是一类重要的神经营养因子，在调控神经元增殖、分化、成熟及促神经元再生方面发挥重要作用，是目前抑郁症研究的核心因子[5]。BDNF表达受到包括环磷酸腺苷（cyclicadenosine monophosphate，cAMP）反应元件结合蛋白（cAMPresponse element binding protein，CREB）在内的多种信号调控，且其活性需与酪氨酸激酶受体B（tyrosinekinase receptor，TrkB）受体结合[6-7]，BDNF/TrkB信号传导的激活导致CREB的磷酸化。因此，本研究重点基于BDNF/TrkB/p-CREB信号介导的神经再生考察血府逐瘀胶囊改善PSD作用机制，以期为血府逐瘀方临床应用提供实验依据。SPF级雄性Wistar大鼠90只，体质量270～300 g，购自北京维通利华生物科技有限公司，许可证号SCXK（京）2016-0006。动物饲养室调节灯光12 h昼夜交替，温度（24±2）℃，相对湿度（35±5）%，自由进食饮水。动物实验经天津中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号TCM-LAEC2021271）。血府逐瘀胶囊（0.4 g/粒，批号BL03223）由天津宏仁堂药业有限公司提供；氟西汀（批号H20073985）购自山西仟源医药集团股份有限公司；多巴胺（dopamine，DA，批号D9520）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT，批号SA5230）、尼氏染色试剂盒（甲基紫法，批号G1432）、DAPI（批号C0065）、抗荧光淬灭封片剂（批号S2110）、苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（批号G1120）、驴血清（批号SL050）均购自北京Solarbio公司；巢蛋白（neuroepithelial stem cellprotein，Nestin）抗体（批号bs-8203R）、双皮质素（doublecortin，DCX）抗体（批号bs-20797R）购自北京博奥森生物技术有限公司；5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）抗体（批号AB6326）、Alexa Fluor488标记驴抗小鼠二抗（批号ab150105）、Alexa Fluor 647标记驴抗兔二抗（批号ab150075）购自英国Abcam公司；β-actin抗体（批号AP0060）购自Bioworld公司；BDNF抗体（批号PB9075）、TrkB抗体（批号PB0475）均购自武汉博士德生物有限公司；p-CREB抗体（批号AP0019）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；羊抗兔二抗（批号A0208）购自上海碧云天生物技术有限公司。R500型通用型小动物麻醉机（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；Agilent 1260 Infinity II型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；DM750型倒置荧光显微镜（德国Leica公司）；Spark酶标仪（瑞士Tecan公司）。采用短暂大脑中动脉梗塞（transientmiddle cerebral artery occlusion，tMCAO）联合慢性不可预见温和应激法（chronic unpredictable mild stimulation，CUMS）进行造模[8-13]。大鼠经异氟烷麻醉后，分离颈部肌肉，暴露血管，分离右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉。从右侧颈内动脉插入线栓向前推进至大脑中动脉，插入线栓60 min后，缓慢拔除线栓，恢复供血。假手术组仅做颈外动脉结扎处理。术后第8天应激开始，28 d内随机接受7种不同的应激方式：①24 h内大鼠禁食；②24 h内大鼠禁水；③昼夜颠倒；④潮湿垫料；⑤水平摇晃；⑥45°斜笼24 h；⑦4 ℃冰水游泳。每日1种，每1种出现4次且每种刺激不重复出现[14]。将大鼠随机分为假手术组、模型组及血府逐瘀低、高剂量（0.43、0.86g/kg，分别相当于1、2倍临床等效剂量）组和氟西汀（1.8 mg/kg）组，每组18只。术后第8天开始应激并ig药物，假手术组和模型组ig等体积蒸馏水，1次/d，连续28 d。术后经神经功能缺损评分进行重新分组，最后选取每组15只进行后续的实验验证。在tMCAO复合CUMS造模以及药物治疗过程中，共有9只大鼠死亡。于大鼠应激第28天，采用Longa神经功能评分[15]评定大鼠神经功能缺损。于大鼠开始应激后第29天，进行糖水偏好实验、旷场实验、强迫游泳实验。2.4.1 糖水偏好实验 各组大鼠在应激后第29天进行糖水偏好实验[16]，并计算糖水偏好率。糖水偏好率＝糖水消耗量/(纯水消耗量＋糖水消耗量)2.4.2 旷场实验 旷场实验采用开口的观察盒（100 cm×100 cm×40 cm）并用与大鼠毛色相反的颜色覆盖满内壁，将底部分为25等份的方块。把大鼠置于观察盒底的中央部分（50 cm×50 cm）适应1 min，然后开始测试，用摄像机记录5 min内总距离和直立次数[17]。2.4.3 强迫游泳实验 强迫游泳实验通过圆柱形透明Pyrex游泳筒完成，筒高40 cm，筒底部直径20 cm，水深30 cm，水温23～25 ℃，记录6 min内大鼠静止不动行为的时间评价大鼠的绝望行为[16,18]。2.5 HPLC检测大鼠前额叶皮质及海马DA和5-HT含量2.5.1 样品制备 将各组大鼠麻醉，心脏灌流后，迅速断头取脑，放置在冰盒上，迅速剥离出脑组织，剥离出前额叶皮层、海马。组织称定质量后，以10 μL/mg比例加入0.1mol/L高氯酸溶液，4 ℃、14000 r/min离心20 min，取上清液，置于冰上备用。2.5.2 对照品溶液的制备 精密称取10 mg DA和10 mg 5-HT，分别添加高氯酸定容至10 mL，过0.22 μm微孔滤膜，取滤液备用。2.5.3 色谱条件 Waters 反相C18色谱柱（150 mm×4.5 mm，5 μm）；流动相为10%乙腈-90%缓冲盐溶液（含醋酸钠0.041 mol/L、柠檬酸0.025 mol/L、辛烷磺酸钠0.92 mmol/L、EDTA-2Na 0.001 2 mmol/L）；柱温35 ℃；体积流量1 mL/min；进样体积10 μL。2.5.4 DA和5-HT含量测定 采用标准曲线回归方程及相关系数进行含量计算。2.6 血府逐瘀胶囊对PSD模型大鼠神经再生的影响2.6.1 免疫荧光检测新生神经元数量 行为学实验结束后，各组大鼠麻醉后心脏灌流，迅速剥离大脑，4%多聚甲醛室温固定24 h。将标本转入10倍体积的30%蔗糖溶液，4 ℃脱水至组织沉底，OCT包埋，冷冻至OCT完全凝固，使用冷冻切片机切片。取冰冻切片室温放置30 min，柠檬酸盐缓冲液热修复10 min，0.25% Triton X-100通透10 min，10%驴血清孵育30 min，分别滴加一抗BrdU（1∶200）、Nestin（1∶200）、DCX（1∶200），4 ℃孵育过夜，37 ℃复温后，滴加荧光二抗（1∶1000），避光孵育2 h，DAPI孵育5 min，滴加抗荧光淬灭封片剂，盖玻片封片，显微镜下观察，采集图像进行分析。2.6.2 Western blotting检测海马BDNF、TrkB和p-CREB蛋白表达 取海马组织30 mg，按20∶1的比例加入含有蛋白酶抑制剂的裂解液600 μL，振荡研磨，冰上裂解30min后，4 ℃、14 000 r/min离心10 min，取上清，BCA法测定样品蛋白浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入兔源β-actin（1∶500）、BDNF（1∶1000）、TrkB（1∶1000）以及p-CREB（1∶1000）抗体，4 ℃孵育过夜，加入羊抗兔二抗（1∶1000）室温孵育2 h，TBST洗膜5次，5 min/次。加入ECL化学发光显影液显影后，Image J软件进行结果分析。采用SPSS25.0软件进行处理、分析与统计，数据用表示，GraphPad Prism 8.0软件进行数据图形绘制。多组间比较，若符合正态性检验，则采用单因素方差分析，并采用Tukey法进行两两比较，若不符合则采用Kruskal-Wallis秩和检验。3.1 血府逐瘀胶囊对PSD模型大鼠神经功能的影响如图1所示，在应激28d后，与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分显著升高（P＜0.001），提示造模后大鼠存在神经功能损伤；与模型组比较，各给药组大鼠神经功能评分均显著降低（P＜0.01），表明血府逐瘀胶囊具有改善PSD大鼠神经功能损伤的作用。3.2 血府逐瘀胶囊对PSD模型大鼠抑郁样症状的影响为考察血府逐瘀胶囊对PSD大鼠抑郁样症状的改善作用，采用糖水偏好、强迫游泳实验、旷场实验来考察PSD模型大鼠的抑郁状态，糖水偏好率越高，游泳不动时间越短、直立次数越多、总距离越远，则说明大鼠抑郁症状改善。如图2所示，与假手术组比较，模型组大鼠糖水偏好率显著下降（P＜0.05），游泳不动时间显著增长（P＜0.05），活动总距离和直立次数有减少趋势，表明动物出现明显抑郁样症状，PSD造模成功；与模型组比较，各给药组大鼠糖水偏好率明显升高（P＜0.05），游泳不动时间均明显减少（P＜0.05、0.01），旷场运动总距离均有增加的趋势，但无统计学差异。血府逐瘀胶囊低剂量组大鼠直立次数显著增加（P＜0.05），血府逐瘀胶囊高剂量组和氟西汀组大鼠直立次数有增加的趋势，但无统计学差异。结果表明血府逐瘀胶囊具有改善PSD大鼠抑郁样症状的作用。3.3 血府逐瘀胶囊对PSD模型大鼠前额叶皮质及海马神经递质含量的影响脑内单胺类神经递质水平（如DA、5-HT）降低是抑郁症主要病理特征，因此考察了血府逐瘀胶囊对PSD大鼠脑内神经递质的影响。如图3所示，与假手术组比较，模型组大鼠前额叶皮质DA含量和海马DA、5-TH含量均明显降低（P＜0.05），前额叶皮质5-HT有降低趋势；与模型组比较，血府逐瘀胶囊低剂量组和氟西汀组前额叶皮质DA、5-HT含量均显著增加（P＜0.05、0.01），血府逐瘀胶囊高剂量组和氟西汀组海马DA含量均显著增加（P＜0.05），血府逐瘀胶囊低剂量组海马5-HT含量显著增加（P＜0.05），表明血府逐瘀胶囊具有增加PSD大鼠脑内神经递质含量的作用。3.4 血府逐瘀胶囊对PSD模型大鼠神经再生的影响神经再生障碍是抑郁症的重要病理特征，促神经再生可减轻焦虑和抑郁样行为。因此考察了血府逐瘀胶囊对PSD模型大鼠神经再生的影响。如图4所示，与假手术组比较，模型组大鼠海马中DCX、BrdU的阳性细胞数量显著降低（P＜0.05、0.01），Nestin的阳性细胞数量有减少趋势；与模型组比较，血府逐瘀胶囊低剂量组BrdU、Nestin、DCX阳性细胞数量显著增加（P＜0.05、0.01），氟西汀组DCX阳性细胞数量显著增加（P＜0.05），Nestin和BrdU有所增加。结果表明血府逐瘀胶囊能够促进PSD大鼠的海马新生神经元数量增加。3.5 血府逐瘀胶囊对PSD模型大鼠海马BDNF、TrkB和p-CREB蛋白表达的影响BDNF的表达受到多种信号通路的调节，BDNF与TrkB受体结合后激活相关信号通路，使CREB磷酸化，从而调节BDNF的表达。如图5所示，与假手术组比较，模型组大鼠海马组织BDNF、TrkB和p-CREB蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，血府逐瘀胶囊低剂量组TrkB、p-CREB蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05），BDNF表达有增加趋势；氟西汀组p-CREB蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），BDNF、TrkB表达有增加趋势。结果表明血府逐瘀胶囊可通过BDNF/TrkB/p-CREB通路对PSD大鼠起到治疗作用。PSD是一种高发的卒中相关情绪障碍，症状包括情绪低落、快感缺乏、精力丧失、注意力下降、精神迟钝、失眠或嗜睡和内疚等。这些情绪障碍对患者卒中后的预后产生负面影响，患者日常活动依赖性增加、认知较差、社交活动延迟、康复效率降低，降低患者生活质量，增加死亡率[19-21]。但抑郁症状在卒中幸存者中较为普遍，这与社会关系、健康程度和受教育程度具有一定相关性[22-23]。PSD对于中医来说可称之为“中风”和“郁症”的合病。血府逐瘀汤方中君药红花善活血、散瘀以止痛，桃仁善破血、行滞而润燥，红花和桃仁相互配合，增强活血化瘀的力量。川芎善行气活血、祛风止痛；赤芍善清热凉血、散瘀止痛、活血化瘀止痛以助君药；牛膝长于祛瘀通脉，引瘀血下行，3药共为臣药。生地黄凉血清热，以除瘀热；枳壳理气宽中疏胸中气滞；当归养血活血润燥，祛瘀生新不伤正；桔梗宣散肺气，以利宽中理气，并载药上行，与枳壳配伍，升降相辅，开胸行气；柴胡疏肝解郁、升举清阳，共为佐药。甘草调和诸药又缓急止痛，其为使药。本方活血行气、祛瘀生新，既解血的瘀滞，又解气的郁结，可作为通治一切血瘀气滞的基础方[24-26]，是活血理气的代表方药。血府逐瘀胶囊是经过现代制剂及加工工艺制成的中成药，制剂工艺和药效物质相对明确。本课题组前期研究也发现血府逐瘀胶囊可以通过改善肠屏障功能而间接发挥脑保护防治PSD的药效作用[27]，然而其脑内相关效应机制尚不清楚。本研究首先通过神经功能评分、行为学、神经递质水平等确认了血府逐瘀胶囊防治PSD的药效作用，发现血府逐瘀胶囊明显改善了PSD大鼠的神经功能损伤，提高了PSD大鼠糖水偏好率，提升了其自主活动能力，明显缩短了PSD大鼠的不动时间。“单胺假说”是抑郁症的一个重要假说，它表明DA、5-HT和去甲肾上腺素在抑郁症中起着关键作用[28]。本研究结果表明，PSD大鼠前额叶皮质以及海马中DA和5-HT含量均降低，经过血府逐瘀胶囊治疗后明显地恢复，证明在血府逐瘀胶囊干预后可以增加PSD大鼠中神经递质的含量。BrdU在神经科学研究中经常被用作新分裂细胞的标志，被认为是鉴定神经再生的“金标准”方法[29]。Nestin是神经上皮干细胞蛋白，Nestin表达细胞经常出现在神经再生区域，并且在神经干细胞的自我更新和存活中具有重要作用[30-31]。DCX是迁移和分化神经元中包含的微管相关蛋白之一，在发育和成熟中枢神经系统的神经元前体中特异性表达，神经元前体细胞的迁移与DCX的表达有关，并且DCX在分化的神经元中表达，表明DCX在神经元可塑性、轴突生长或合成中都起到重要作用。因此，DCX经常被用作新生成神经元而非神经胶质细胞的标志[32-33]。为探究血府逐瘀胶囊在神经再生机制方向的治疗作用，采用免疫荧光检测BrdU、DCX和Nestin的表达，发现相较于PSD大鼠，血府逐瘀胶囊低剂量组以上蛋白表达均有增加，说明血府逐瘀胶囊干预后可增加PSD大鼠海马新生神经元数量，为血府逐瘀胶囊治疗PSD的神经再生机制探究奠定了基础。BDNF通过影响细胞分化、神经元发育、生长和存活、神经发生、突触发生和突触可塑性，在神经系统发育中起关键作用[34]。研究报道，BDNF水平降低与脑卒中后抑郁样行为增加之间存在很强的相关性，脑卒中人类患者血清BDNF水平降低，因此，BDNF的表达变化在PSD的发生发展中可能起关键作用[35]。从树突释放的成熟BDNF可与特异性受体TrkB结合并激活TrkB受体，在神经元生长、成熟（分化）和维持中起到重要作用[36-37]。CREB是胚胎皮质神经元中BDNF诱导基因表达的重要调节因子，参与调节神经元生长发育、突触可塑性和长期记忆形成，CREB磷酸化激活可抑制细胞凋亡并促进损伤后的细胞分化和修复[38]。CREB在BDNF/TrkB信号传导被激活后被磷酸化，上调BDNF的表达[39]。这是一种目前广泛认可与抑郁和抗抑郁样反应有关的转录因子。BDNF/CREB信号被认为是细胞存活、突触结构等许多神经元生物学过程中的关键信号[40]。本研究通过Western blotting检测海马BDNF、TrkB、p-CREB蛋白的表达，给予血府逐瘀胶囊干预后发现，海马中BDNF、TrkB、p-CREB蛋白的表达相较于模型组大鼠明显升高，表明血府逐瘀胶囊可通过BDNF/TrkB/p-CREB通路发挥对PSD的治疗作用。综上，本研究证实了血府逐瘀胶囊对PSD的潜在治疗作用。并且发现其可通过BDNF/TrkB/p-CREB通路促进神经再生，进而发挥防治PSD的作用。本研究对血府逐瘀胶囊的现代研究和临床合理用药具有一定参考价值，并为进一步深入探究血府逐瘀胶囊防治PSD的作用机制提供线索。来 源：樊薛津，金博文，杨秋怡，葛士宁，宋 纹，张 营，王跃飞，庄朋伟，张艳军，尹清晟，张密霞．基于BDNF/TrkB/p-CREB信号通路探讨血府逐瘀胶囊促进神经再生防治卒中后抑郁的作用及机制 [J]. 中草药, 2023, 54(20): 6704-6411.
